W tym samym roku eksperci FAO po raz pierwszy określili listę produktów spożywczych stanowiących główne źródła antygenów odpowiedzialnych za 90% wszystkich alergii pokarmowych: mleko krowie, jaja, ryby, skorupiaki, orzechy, orzeszki arachidowe, soja i pszenica (tzw. „wielka ósemka alergenów pokarmowych”)[i]. W późniejszych latach pojawił się jeszcze termin „nadwrażliwości pokarmowej”. Ważne jest, aby poprawnie rozróżnić te terminy, ponieważ alergia pokarmowa jest nadwrażliwością pokarmową alergiczną – immunologiczną. To sytuacja, w której dochodzi do nadmiernej, opacznej (niewłaściwej, niepożądanej) reakcji układu odpornościowego w wyniku spożycia nawet bardzo niewielkiej ilości pokarmu[ii]. Inne reakcje organizmu możemy uznać za nadwrażliwość pokarmową niealergiczną, czyli nieimmunologiczną, np. celiakia. Mogą jej towarzyszyć podobne objawy kliniczne, co przy alergii pokarmowej, ale nie są one udziałem układu odpornościowego. W tym przypadku reakcja organizmu wywołana jest alergenem, mającym kontakt z układem odpornościowym organizmu i mobilizującym go do reakcji obronnej[iii]. Same alergeny też można podzielić na te pochodzenia zwierzęcego (np. mleko, ryby, jaja) oraz roślinnego (np. zboża, rośliny strączkowe, orzechy, gorczyca)[iv]. Obecnie ocenia się, że częstość alergii pokarmowych kształtuje się na poziomie 4-8% populacji dzieci oraz 2-3% dorosłych[v]. Nawet 20% populacji modyfikuje swoją dietę z powodu nadwrażliwości pokarmowej[vi]. Badania wykazują wzrost występowania nadwrażliwości pokarmowej. Sukcesywnie odnotowywana jest większa liczba chorych na astmę oskrzelową i alergiczny nieżyt nosa, szczególnie w krajach zachodnich[vii]. W konsekwencji żywność jest poddawana coraz większym restrykcjom, zwłaszcza pod względem właściwego oznaczania alergenów, co jest zabezpieczeniem nie tylko dla konsumenta, ale także dla producenta, który obniża tym samym prawdopodobieństwo ponoszenia konsekwencji prawnych z powodu powikłań zdrowotnych osoby, która spożyła oferowany przez niego środek spożywczy.

Z punktu widzenia nakładanych na przedsiębiorców z sektora spożywczego obostrzeń prawnych, prawo unijne w swoich podstawowych regulacjach jasno określa wszelkie zasady dotyczące znakowania żywności. Najbardziej znanym aktem jest oczywiście rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności (…). Wskazuje ono, że podawanie informacji o składnikach lub substancjach pomocniczych, które mogą wywołać alergie lub reakcje nietolerancji, a są wskazane w niniejszym rozporządzeniu, jest obowiązkowym elementem znakowania żywności[viii]. Ponadto, określa w jaki sposób oznaczać alergeny, a co najważniejsze – tworzy wykaz alergenów, którymi są zboża zawierające gluten, skorupiaki, jaja, ryby, orzeszki ziemne, soja, mleko, orzechy, seler, gorczyca, nasiona sezamu, dwutlenek siarki i siarczyny, łubin i mięczaki. Nie pozostawia też nieuregulowanej kwestii produktów nieopakowanych, w stosunku do których w polskim systemie prawnym wydane zostało rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 23 grudnia 2014 r. w sprawie znakowania poszczególnych rodzajów środków spożywczych. Do rozporządzenia 1169/2011 zostało wydane zawiadomienie Komisji z dnia 13 lipca 2017 r. dotyczące przekazywania informacji o substancjach lub produktach powodujących alergie lub reakcje nietolerancji (…) (2017/C 428/01). Ostatnim aktem regulującym kwestię alergenów jest rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) nr 828/2014 z dnia 30 lipca 2014 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat nieobecności lub zmniejszonej zawartości glutenu w żywności, czyli na jakich zasadach możemy posługiwać się sformułowaniami „bezglutenowy” oraz „o bardzo niskiej zawartości glutenu”. Jedyne, co nie zostało uregulowane, w przeciwieństwie do tematu glutenu, to dopuszczalne poziomy pozostałych alergenów w żywności.

Skoro przedsiębiorcy wiedzą, w jaki sposób znakować środki spożywcze, to konieczne jest wskazanie, w jaki sposób wykrywać alergeny w żywności. Jest to przydatne w sytuacji, kiedy np. konieczne jest wyczyszczenie taśmy produkcyjnej, na której znajdowały się produkty zawierające alegeny, a następnie na tę samą taśmę mają trafić produkty, które takich alergenów nie posiadają lub są ich całkowicie pozbawione. To sytuacje tzw. alergii krzyżowych, które nie są regulowane przez przepisy prawne, a informacje o nich są podawane przez producentów dobrowolnie.

Metod wykrywania alergenów w żywności jest aktualnie wiele. Są to metody biologiczne i fizykochemiczne pozwalające na wykrycie samego alergenu lub markera wskazującego na jego obecność – białka charakterystyczne dla danej alergizującej żywności lub charakterystyczne fragmenty DNA (genu kodującego białko). Coraz bardziej popularna jest także metoda spektroskopii mas, która umożliwia oznaczenie budowy związków chemicznych oraz składu chemicznego złożonych mieszanin[ix].

Metody immunologiczne są najczęściej wykorzystywane do wykrywania śladowych ilości alergenów. Opierają się na wiązaniu alergennego białka przez specyficzne przeciwciała[x]. Najbardziej popularne w tej kategorii są testy immunoenzymatyczne (ELISA) i testy paskowe.

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) służy do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych znakowanych enzymem[xi]. Jest to jeden z najczęściej stosowanych testów. Zasada działania i jednocześnie wysoka czułość testu ELISA związana jest z unieruchomieniem badanego białka (alergenu) na podłożu stałym (płytce), a następnie na wykryciu go za pomocą przeciwciała znakowanego enzymem (tj. przeciwciała detekcyjnego). Po utworzeniu kompleksu immunologicznego niezwiązane przeciwciała usuwa się poprzez wypłukanie płytki. Następnie dodaje się substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem. Wynikiem zajścia reakcji enzymatycznej jest pojawienie się barwnego produktu[xii]. Istnieją różne rodzaje testów ELISA, jednak pod kątem żywności swoje zastosowanie znajdują dwa – test podwójnego wiązania (tzw. kanapkowy, s-ELISA) i konkurencyjny (c-ELISA)[xiii]. Testy ELISA mogą być wykorzystywane w przemyśle spożywczym do rutynowych pomiarów, jak i skriningu alergenów w żywności. Dzięki wysokiemu potencjałowi standaryzacji i automatyzacji metoda ta daje możliwość jednoczesnego analizowania dużej liczby próbek w kierunku oznaczenia różnych alergenów.

Testy paskowe opierają się na tworzeniu kompleksów między kolorowymi kulkami pokrytymi przeciwciałami przeciw alergenowi z białkami alergennymi w próbce i przeciwciałami antyalergicznymi na pasku testowym. Kompleksy te powodują powstanie kolorowej linii testowej na pasku, co wskazuje na pozytywną (zawierającą alergen) próbkę. W podobny sposób powstaje kolorowe pasmo kontrolne wskazujące, że test został przeprowadzony poprawnie[xiv]. Stanowią one uproszczoną wersję testów ELISA i są łatwe do stosowania w terenie – samo użycie nie jest skomplikowane, a wynik pojawia się bardzo szybko, bo możemy go mieć nawet po 3 – 15 minutach. Bardzo często są stosowane w zakładach produkcji żywności, gdzie może dojść do krzyżowego zanieczyszczenia. Tego typu testy są również rutynowo stosowane do detekcji żywności genetycznie zmodyfikowanej, dodatków GM oraz oznaczania mikotoksyny w surowcach i gotowych produktach spożywczych[xv].

Technologią analizy alergenów, która zyskuje coraz większą popularność jest wykorzystanie biosensorów. Dają one możliwość szybkiej i czułej detekcji analitu (podlegający oznaczaniu składnik próbki analitycznej) dzięki zastosowaniu biocząsteczek w połączeniu z czułymi przetwornikami fizykochemicznymi[xvi]. Chodzi o zmiany współczynnika załamania światła na powierzchni chipu czujnika, spowodowanych wiązaniem analitu z unieruchomionym ligandem. Wiązanie alergenów w próbce śledzi się w czasie rzeczywistym, a ze zmiany sygnału można obliczyć stężenie[xvii]. Bardzo dużą zaletą tej metody jest krótki czas przeprowadzania samego testu, wysoka automatyzacja skracająca czas pracy, możliwość jednoczesnego wykrywania kilku analitów, czy też wykrywanie ich bez etykiet[xviii]. Jak każda metoda, tak i ta ma swoje minusy, a największym z nich jest wysoka cena.

Kolejnym rodzajem metod są oparte na analizie i wykryciu charakterystycznych fragmentów DNA. Metody umożliwiające wykrycie fragmentów DNA stanowiących markery obecności alergennych składników opierają się na łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polimerase chain reaction, PCR). Została ona opracowana przez Kary’ego Mullisa w latach 80-tych. Podstawą techniki PCR jest amplifikacja (powielenie) zdefiniowanych sekwencji DNA przy użyciu enzymu polimerazy DNA[xix]. Metoda ta wykorzystuje zdolności polimerazy DNA do syntezy nowej nici DNA komplementarnej do oferowanej nici matrycy. Ponieważ polimeraza DNA może dodawać nukleotyd tylko do istniejącej wcześniej grupy 3’-OH, potrzebuje startera, do którego może dodać pierwszy nukleotyd. Wymóg ten umożliwia wyznaczenie określonego regionu sekwencji szablonów, który chcemy wzmocnić. Pod koniec reakcji PCR określona sekwencja zostanie zgromadzona w miliardach kopii (amplikonów)[xx]. Aktualnie bardzo często spotyka się tę metodę w przypadku wykrywania obecności takich alergenów, jak sezam, łubin, seler, pistacje, orzeszki ziemne, gorczyca, migdały czy orzechy makadamia.

Ostatnią metodą wykrywania alergenów w żywności jest spektometria mas (ang. mass spectometry, MS). Jest pomocna w szczególności co do zanieczyszczeń krzyżowych, które mogą nadać fałszywie pozytywny wynik obecności alergenu. Spektometria mas jest uniwersalną techniką analityczną pozwalającą na jednoznaczną identyfikację związków na podstawie analizy stosunku ich masy do ich ładunku elektrycznego. Efekt ten uzyskuje się poprzez jonizację cząsteczek lub atomów, a następnie detekcję liczby powstających jonów i określenie stosunku ich masy do ładunku. Wyniki działania spektometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego[xxi]. Jak widać powyżej wybór metod wykrywania alergenów w żywności jest szeroki i każda z nich ma swoje zalety, jak i wady. Przy wyborze należy się kierować przede wszystkim możliwościami danego przedsiębiorcy, jeżeli to on wykonuje badania i okolicznościami, w jakich mają one miejsce. Na podstawie wieloletniego doświadczenia, m.in. w zakresie alergenów wiemy, że wymogi, jakie są stawiane przedsiębiorcom mogą mieć swoje odzwierciedlenie w szczególności w nakładzie finansowym, jaki trzeba mieć, aby zapewnić bezpieczeństwo przede wszystkim konsumentom i uniknąć sytuacji, w których zarówno wizerunek firmy, jak i czyjekolwiek zdro

---

[i] J. Jasnowska – Małecka, Biologiczne metody wykrywania alergenów w żywności, Zeszyty Naukowe/Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.

[ii] Ibidem.

[iii] B. Wróblewska, Wielka ósemka alergenów pokarmowych, Alergia 2002, vol. 4.

[iv] Z. Bartuzi, Nowe spojrzenie na alergeny pokarmowe, Alergia 2011, 2.

[v] M. Kaczmarski, E. Korotkiewicz-Kaczmarska, A. Bobrus-Chociej, Aspekty epidemiologiczne, kliniczne i społeczne alergii pokarmowej. Cz. III. Aspekty społeczne alergii pokarmowej, Przegląd Pediatryczny 2009, 39.

[vi] I. Skypala, Nadwrażliwość pokarmowa — alergia i nietolerancja pokarmowa, w: A. Payne, H. Barker, Dietetyka i żywienie kliniczne, Elsevier Urban & Partner, 2013.

[vii] B. Björkstén, T. Clayton, P. Ellwood, A. Stewart, D. Strachan, ISAAC Phase III Study Group: Worldwide time trends for symptoms of rhinitis and conjunctivitis: Phase III of the International Study of Asthma and Allergies in Childhood, Pediatr, Allergy Immunol 2008, 19.

[viii] Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004, Dz. Urz. UE L 304/18 z 22.11.2011, art. 9 ust. 1 pkt c).

[ix] J. Jasnowska – Małecka, Biologiczne metody wykrywania alergenów w żywności, Zeszyty Naukowe/Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.

[x] T. Hirao, S. Imai, H. Sawada, N. Shiomi, S. Hachimura, H. Kato, PCR method for detecting traceamounts of buckwheat (Fagopyrum spp.) in food.Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69.

[xi] T. Holzhauser, O. Stephan, S. Vieths, Polymerasechain reaction (PCR) methods for the detection ofallergenic foods, w: Detecting Allergens in Food, CRCPress, Boca Raton 2006.

[xii] J. Jasnowska – Małecka, Biologiczne metody wykrywania alergenów w żywności, Zeszyty Naukowe/ Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.

[xiii] P. Schubert-Ullrich, J. Rudolf, P. Ansari, B. Galler, M. Führer, A. Molinelli, S. Baumgartner, Commercialized Rapid Immunoanalytical Tests for Determi- nation of Allergenic Food Proteins: an Overview, Analytical and Bioanalytical Chemistry 2009, vol. 395.

[xiv] R. L. Valluzzi, V. Fierro, S. Arasi, M. Mennini, V. Pecora, A. Fiocchi, Allergy to food additives, Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2019, 19, 3.

[xv] Linkiewicz, Wiśniewska i Sowa 2006, www.fabimex.com.pl/oferta; www.nuscana.pl

[xvi] J. Jasnowska-Małecka, M. Filipiak, Biosensor DNA do oznaczania heterocyklicznych amin aromatycznych w żywności, Zeszyty Naukowe/Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.

[xvii] R. L. Valluzzi, V. Fierro, S. Arasi, M. Mennini, V. Pecora, A. Fiocchi, Allergy to food additives, Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2019, 19, 3.

[xviii] E. Kress-Rogers, Instrumentation for food quality assurance, w: E. Kress-Rogers, C.J.B. Brimelow, Instrumentation and Sensors for the Food Industry, Woodhead Publishing Limited, 2001.

[xix] M. Ligaj, S. Sacharowski, Wykrywanie bakterii Aeromonas hydrophila z zastosowaniem techniki multipleks PCR, Zeszyty Naukowe/Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.

[xx] Ibidem.

[xxi] J. Jasnowska – Małecka, Biologiczne metody wykrywania alergenów w żywności, Zeszyty Naukowe/ Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu 2011, 183.